محصولات آزمایشگاه هدف‌گیری ژن
نوزاد موش‌های تراریخت Tg(CAG-EGFP) به رنگ سبز در کنار نوزاد موش‌های معمول
دست‌ورزی ژنتیکی در این موش به گونه‌ای اتفاق افتاده است که تمامی سلولهای آن می‌تواند پروتئین فلورسنت سبزرنگ (EGFP) را تولید نماید بنابراین تمام سلولهای این موش در زیر نور فلورسنت به رنگ سبز مشاهده می‌شوند علاوه بر این تمامی سلولهای این موش دارای ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک پیرومایسین نیز هستند.
بافت پانکراس جداسازی شده از موش تراریخت Tg(Pdx1-EGFP) که توده سلولهای بتای سبز رنگ با نور فلورسنت قابل شناسایی هستند.
در این موش تراریخت تنها یک بافت اختصاصی در بدن موش قابلیت تولید پروتئین فلورسنت سبزرنگ (EGFP ) را دارد. دست‌ورزی ژنتیکی در این موش به گونه‌ای اتفاق افتاده است که پروتئین فلورسنت سبزرنگ فقط در سلولهای بیان کننده ژن Pdx1 تولید می‌شود و این سلول‌ها که در جزایر لانگرهانس بافت پانکراس موش قرار دارند در زیر نور فلورسنت به رنگ سبز مشاهده می‌شوند. این موش تراریخت ابزار بسیار کاربردی و مهم در مطالعات سلولی در حوزه بیماری دیابت می‌باشد.
اولین موش تراریخت به روش Knock-In کشور در آزمایشگاه هدف‌گیری ژن پژوهشگاه رویان در تاریخ 8/1/1395 تولید شد. در این موش تراریخت، ژن Zfp521 با قابلیت بیان القاءپذیر با استفاده از سامانه نوین CRISPR/Cas9 در لوکوس ROSA26 وارد شده است. ژن Zfp521 از فاکتورهای القای سایر سلول‌ها به سلولهای عصبی است در مطالعه‌ای که توسط گروه عصب پژوهشگاه رویان کشف گردید (Shahbazi et al, 2015 stemcell report) نشان داده شد که این فاکتور رونویسی می تواند موجب دگرتمایزی سلولهای سوماتیک به سلولهای بنیادی عصبی شود. تمام سلولهای این موش قابلیت القاء بیان Zfp521 و تبدیل شدن به سلولهای عصبی را دارند و در نتیجه این حیوان را به مدلی فوق‌العاده برای مطالعات جدید در حوزه بیماری‌های تخریب عصبی تبدیل کرده است.
با داشتن قابلیت بیان القاءپذیر ژن Zfp521 در موش تراریخت ZFP Knock-In، با اضافه کردن داکسی‌سایکلین به سلولهای فیبروبلاستی جنینی موش تراریخت، این سلول‌ها تبدیل به سلول های عصبی شدند. a) نورون‌های بالغ bوc) بیان مارکرهای عصبی Nesti و Sox d) رنگ آمیزی هسته با DAPI
در این موش Knock-In با استفاده از سامانه CRISPR/Cas9 و همچنین بهره بردن از سلولهای بنیادی جنینی موشی، ژن‌های گزارشگر mRFP و mGFP در لوکوس ROSA26 وارد شده است. در این موش پروتئین فلورسنت قرمز (mRFP) در تمامی بافت‌ها تولید می شود و در زیر نور فلورسنت به رنگ قرمز است اما پروتئین فلورسنت سبز ( mGFP ) در صورت حضور آنزیم Cre و غیر فعال شدن ژن mRFP ، تولید می‌شود و در زیر نور فلورسنت به رنگ سبز است. همچنین مکان تولید این پروتئین بستگی به پروموتر آنزیم Cre دارد. با توجه به شرطی بودن تولید پروتئین‌های فلورسنت قرمز و سبز در سلولهای این موش، به راحتی می‌توان مطالعات مربوط به ردیابی دودمان سلولی را با استفاده از این موش انجام داد.
نوزاد موش mT/mG که تمام قسمت‌های بدن موش با نور فلورسنت به رنگ قرمز مشاهده می‌شود که در کنار یک نوزاد موش معمولی قرار گرفته است. WT: نوزاد موش معمولی
خدمات آزمایشگاه
بعد از لقاح اسپرم و تخمک موش، پیش هسته‌های نر و ماده برای چند ساعت بصورت جدا از هم داخل زیگوت می‌مانند. پیش هسته‌های نر عموماً اندازه بزرگتری را نسبت به پیش هسته‌های ماده دارند. بنابراین این زمان فرصت مناسبی است تا سازه ژنی به داخل آن تزریق شود. پس از چند ساعت پیش هسته‌ها در هم ادغام شده‌اند و به رحم موش مادر رضاعی یا حاملة کاذب انتقال داده می‌شوند. در صورتیکه سازه ژنی تزریق شده وارد ژنوم شده و جنین دربردارنده آن به روند تکوین طبیعی ادامه داده باشد، موش‌های بدنیا آمده تراریخت بود.
مراحل انجام ریزتزریق به پیش هسته زیگوت موش. a) زیگوت موش به وسیله سوزن نگه‌دارنده ثابت شده است. پیش هسته نر(mp)، پیش هسته ماده (fp)، پولاربادی(pb)، زونا پلوسیدا(zp) و هولدر (hc) (b وارد کردن سوزن ریزتزریق به داخل پیش هسته نر و تزریق سازه ژنی
سلولهای بنیادی جنینی موشی تراریخت به صورت تک سلول در حال ریزتزریق به جنین موش با استفاده از سوزن ریزتزریق
در این تکنیک به منظور تولید موش کایمر، سلولهای بنیادی به مرحله بلاستوسیست جنین موش ریزتزریق می‌شود. تولید موش کایمر یکی از روش‌های معمول در راستای تولید موش‌های تراریخت است. کاربرد دیگر این تکنینک ارزیابی رده‌های سلولی از لحاظ پرتوانی می باشد. در این روش سلولهای بنیادی به صورت تک سلول به حفره بلاستوسل جنین موش ریزتزریق می‌شود. سلولهای ریزتزریق شده با سلولهای ICM بلاستوسیت میزبان ترکیب می‌شوند و در نتیجه بلاستوسیت کایمر تشکیل می‌شود. در صورتی که بلاستوسیت کایمر به موش مادر رضاعی انتقال داده شود و روند طبیعی تکوین خود را طی کند موش کایمر متولد خواهد شد.
کلونی سلولهای بنیادی جنینی موشی الکتروپوریشن شده با ژن EGFP جهت تولید موش تراریخت (Tg(CAG-EGFP (موش سبز)
برای انتقال ژن به سلولهای بنیادی از روش‌های مختلف فیزیکی (مانند ریزتزریق DNA) شیمیایی (مانند لیپوفکشن)، بیولوژیک (مانند انتقال ژن ویروسی) می‌توان استفاده کرد. از میان این روش‌ها، روش فیزیکی الکتروپوریشن به دلیل کارایی مناسب، عدم محدودیت در طول قطعات DNA ورودی، عدم تاثیر منفی بر حیات و به ویژه خصوصیات بنیادگی سلولهای بنیادی جنینی، پرکاربردترین روش تراریخت‌سازی این سلول‌ها است. مبنای این روش بر این اساس است که با ایجاد یک میدان الکتریکی، حفراتی در غشاء سلولی گشوده می‌شود و امکان ورود DNA خارجی به سلول فراهم می‌شود.
تمامی مراحل قبل از لانه گزینی جنین موش به رحم موش گیرنده انتقال داده می شود. این تکنینک برای تولید موش های تراریخت لازم است همچنین ارزیابی لانه گزینی، بلوغ و تولد کلیه جنین های تیمار و دستکاری شده را می توان با این تکنیک انجام داد.
